要成功地執(zhí)行 Duolink® PLA 實驗，實驗方案中有一些必要的考慮因素需要正確地準備、設置和執(zhí)行。Duolink® PLA 產(chǎn)品可用于熒光和明場。熒光 Duolink® PLA 試劑可用于顯微鏡和流式細胞術應用。

一、實驗設計

要設計一個成功的Duolink® PLA實驗，必須考慮很多因素。這些因素包括但不限于：

1.確定蛋白質(zhì)靶標和實驗類型

2.選擇樣品（細胞或組織）

3.設計您的讀出方案

4.設計實驗對照（技術和生物）

靶標識別：

首先要確定的是目標蛋白靶標。是單一蛋白質(zhì)表達，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用 (PPI)，還是蛋白質(zhì)翻譯后修飾 (PTM)？下面簡要介紹了 Duolink® PLA 如何用于檢測各種類型的蛋白靶點。

單一蛋白表達的檢測：

檢測單個蛋白靶標有兩種方法，即使用針對靶標的一種一抗進行單一識別或兩種一抗進行雙重識別。

單一識別：

具有最高的靈敏度，建議在檢測低表達水平的單一蛋白質(zhì)靶標時使用。也可用于雙重識別實驗前對單個一抗?jié)舛鹊臏y定。但是，只有當性能良好的特異性一抗可用時，才推薦使用此方法。由于測定的敏感性，使用非特異性一抗將導致高背景。

雙重識別：

通過使用兩種一抗提供了更高的特異性。每種一抗必須針對同一靶分子上不同的、非競爭性的表位。而且，這兩種一抗必須在不同物種（小鼠、兔或山羊）中培養(yǎng)，并且必須在相同的實驗條件下與靶標結合。這些條件在下面的實驗準備部分中進行了描述。

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用檢測：

Duolink® PLA是檢測蛋白質(zhì)相互作用的方法。該方法使用兩種一抗來完成，每種抗體針對一種目標靶標，且在不同物種（小鼠、兔或山羊）中培養(yǎng)。兩種一抗必須在相同的實驗條件下與靶標結合。

蛋白質(zhì)與核酸的相互作用檢測：

蛋白質(zhì)-DNA 和蛋白質(zhì)-RNA 相互作用也可以通過使用修飾的原位雜交技術結合Duolink® PLA來進行檢測。

二、實驗準備

為確保成功執(zhí)行 Duolink® PLA 實驗，需要進行大量準備工作。這些準備工作與傳統(tǒng)的 IF、IHC 或流式細胞術所需的工作類似。本節(jié)描述了一抗鑒定、樣品制備和抗體優(yōu)化的注意事項。

一抗的選擇：

Duolink® PLA試劑是使用二抗進行靶標特異性一抗檢測的通用試劑。設置 Duolink® PLA 實驗時，一抗的選擇至關重要。

要求：

Duolink® PLA探針是驢抗小鼠、抗兔或抗山羊二抗；因此，對一抗有特定要求。這包括：

1.IgG 類

2.可以是單克隆或多克隆

3.優(yōu)選親和純化以使交叉反應性最小化

4.建議使用 IF 或 IHC 驗證

5.宿主必須是小鼠、兔子或山羊（特例情況要求使用Duolink® Probemaker）

直接偶聯(lián)一抗的使用：

有些情況下需要使用直接偶聯(lián)的一抗。Duolink® Probemaker能夠將 PLA oligo (PLUS 或 MINUS) 偶聯(lián)到任何抗體上。使用 Duolink® Probemaker 的注意事項如下：

1.當一抗的宿主不是小鼠、兔或山羊時

2.當使用來自同一物種的兩種一抗時

3.當使用在與組織樣品相同的宿主中產(chǎn)生的一抗時（例如，“小鼠一抗檢測小鼠樣品"）

一抗優(yōu)化：

為了成功執(zhí)行 Duolink® PLA 實驗，確定待測樣品中最佳一抗性能的條件非常重要。一抗優(yōu)化的條件應包括：

1.樣品處理（固定、透化和抗原修復）

2.一抗?jié)舛?/span>

3.阻斷溶液和抗體稀釋劑

下面介紹樣品處理、阻斷和抗體稀釋劑的具體注意事項。強烈建議首先通過 IF 或 IHC 染色鑒定一抗的條件。當使用兩種一抗時，每種一抗的優(yōu)化應分開進行，但樣品處理需要兼容兩種一抗的最佳性能。

一旦 通過IF 或 IHC 確定了條件，這些條件就可以應用于 Duolink® PLA。但是，Duolink® PLA 實驗可能需要進一步滴定一抗?jié)舛?，因為與 IF 和 IHC 相比，Duolink® PLA 具有更高的靈敏度和更放大的信號。使用上述Duolink® PLA單一識別方法可在優(yōu)化一抗?jié)舛葧r提供最高的靈敏度。這些條件可用于使用兩種一抗的 Duolink® PLA 實驗。